流式细胞术检测γδΤ细胞内白细胞介素-2的临床应用价值

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-655X.2015.04.018

中华诊断学电子杂志 ›› 2015, Vol. 03 ›› Issue (04) : 292 -295. doi: 10.3877/cma.j.issn.2095-655X.2015.04.018

所属专题：文献；

基础研究

流式细胞术检测γδΤ细胞内白细胞介素-2的临床应用价值

王克强¹, 侯彦强², 冉张申¹, 李湘奇¹^,^†(

), 段衍超¹

^1. 271000　泰安，泰山医学院附属医院检验科
^2. 201600　上海交通大学附属第一人民医院松江分院检验科

收稿日期:2015-08-07 出版日期:2015-11-26
通信作者: 李湘奇
基金资助:
泰安市科技发展计划(20074043，201440774-38B); 山东省高等学校科技计划(J14LL03)

The clinical application of flow cytometry for detecting intracellular IL-2 in γδΤ cells

Keqiang Wang¹, Yanqiang Hou², Zhangshen Ran¹, Xiangqi Li¹^,^†(), Yanchao Duan¹

^1. Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Taishan Medical University, Tai′an 271000, China
^2. Department of Clinical Laboratory, Songjiang District Central Hospital of Shanghai, Shanghai 201600, China

Received:2015-08-07 Published:2015-11-26
Corresponding author: Xiangqi Li
About author:
Corresponding author: Li Xiangqi, Email: drlixqi@126.com

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目的

建立一种人外周血γδΤ细胞细胞内白细胞介素-2(IL-2)的检测方法。

方法

分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)刺激PBMC，获取较高比例的γδΤ细胞。用佛波醇酯＋离子霉素(PMA＋IM)刺激PBMC和γδΤ细胞，用蛋白转运抑制剂(Brefeldin A，BFA)阻断细胞内因子的分泌，用皂角素破膜，流式细胞术检测CD^3＋T细胞内CD69阳性率，以确定最佳的破膜时间，用流式细胞术检测γδΤ细胞内的IL-2的表达。不同组间CD^3＋T细胞内CD69阳性率及细胞内IL-2的阳性率比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性(LSD)法检验．。

结果

刺激时间不同，CD^3＋T细胞胞内CD69的阳性率表达不同，皂角素破膜时间为15 min时，CD^3＋T细胞胞内CD69的阳性率最高，达(87.82±2.28)%，与处理5 min[CD69的阳性率(66.86±1.99)%]和25 min[CD69的阳性率(81.73±2.51)%]比较，差异有统计学意义 (F＝112.81，P<0.05)；不同处理组γδΤ细胞内IL-2表达不同，γδΤ细胞受PMA和IM刺激并有BFA存在时表达最高，达(50.65±6.25)%，与γδΤ细胞组(0.55±0.07)%、γδΤ细胞＋PMA＋IM组(0.91±0.12)%和PBMC＋PMA＋IM＋BFA组(0.21±0.03)%比较，差异有统计学意义(F＝321.07，P<0.05)。

结论

流式细胞术是一种检测γδΤ细胞内IL-2的较好方法，为γδΤ细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础。

关键词: γδΤ细胞, 白细胞介素2, 佛波醇酯类, 离子霉素, 结核杆菌低分子多肽抗原

Objective

To establish a method for detecting intracellular IL-2 in human peripheral blood γδΤ cells.

Methods

Healthy human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated, and then stimulated with low molecular peptide antigen of mycobacterium tuberculosis (Mtb-Ag). A high proportion of γδΤ cells were obtained.PBMCs and γδΤ cells were excited with phorbol myristate acetate (PMA) and ionomycin(IM). Protein transport inhibitor (Brefeldin A, BFA) was used to block the secretion of cytokines and saponin was taken for membrane permeabilization.Flow cytometry was applied to detect the expression of CD69 in CD³⁺ T cells to explore the appropriate time of membrane permeabilization.Then flow cytometry was implemented to detect the expression of intracellular IL-2 in γδΤ cells.Analysis of Variance (ANOVA) and Least Significant Difference(LSD) test were conducted to determine the statistical difference.

Results

CD³⁺ T cells with 15 minutes of membrane permeabilization had the highest expression of CD69 (87.82±2.28)% compared with those with 5 minutes and 25 minutes (F=112.81, P<0.05). γδΤ cells with the stimulation of PMA, IM and blocker of BFA (γδΤ+ PMA+ IM+ BFA) had the highest expression of intracellular IL-2 (50.65±6.25)% compared with γδΤ group, γδΤ+ PMA+ IM group and PBMC+ PMA+ IM+ BFA group(F=321.07, P<0.05).

Conclusion

Flow cytometry is an appropriate method for the detection of intracellular IL-2 in γδΤ cells, and it may be applicable to detecting other cytokines in γδΤ cells.

Key words: γδΤ cells, Interleukin-2, Phorbol myristate acetate, Ionomycin, Antigen of mycobacterium tuberculosis

表1 不同皂角素破膜时间CD^3＋T细胞阳性率和CD^3＋T细胞内CD69表达的比较(%，±s)

破膜时间(min)	样本数	CD3^＋T细胞阳性率	CD3^＋T细胞内CD69表达
5	5	68.25±2.42	66.86±1.99
15	5	66.16±2.13^a	87.82±2.28^d
25	5	58.37±1.89^bc	81.73±2.51^ef
F值	?	29.12	112.81
P值	?	<0.05	<0.05

表1 不同皂角素破膜时间CD^3＋T细胞阳性率和CD^3＋T细胞内CD69表达的比较(%，±s)

破膜时间(min)	样本数	CD3^＋T细胞阳性率	CD3^＋T细胞内CD69表达
5	5	68.25±2.42	66.86±1.99
15	5	66.16±2.13^a	87.82±2.28^d
25	5	58.37±1.89^bc	81.73±2.51^ef
F值	?	29.12	112.81
P值	?	<0.05	<0.05

表2 各组PBMC中CD3^＋T细胞表面及细胞内CD69分子表达的比较(%，±s)

组别	样本数	细胞表面	细胞内
PBMC组	5	0.66±0.08	0.50±0.06
PBMC＋PMA＋IM组	5	63.73±7.25^a	2.79±0.31^d
PBMC＋PMA＋IM＋BFA组	5	4.56±4.06^bc	57.12±0.62^ef
F值	?	242.78	31826.16
P值	?	<0.01	<0.01

表2 各组PBMC中CD3^＋T细胞表面及细胞内CD69分子表达的比较(%，±s)

组别	样本数	细胞表面	细胞内
PBMC组	5	0.66±0.08	0.50±0.06
PBMC＋PMA＋IM组	5	63.73±7.25^a	2.79±0.31^d
PBMC＋PMA＋IM＋BFA组	5	4.56±4.06^bc	57.12±0.62^ef
F值	?	242.78	31826.16
P值	?	<0.01	<0.01

表3 各组别γδΤ细胞内IL-2表达的比较(%，±s)

组别	样本数	IL-2表达
γδΤ细胞组	5	0.55±0.07
γδΤ细胞＋PMA＋IM组	5	0.91±0.12^a
γδΤ细胞＋PMA＋IM＋BFA组	5	50.65±6.25^bc
PBMC＋PMA＋IM＋BFA组	5	0.21±0.03^def
F值	?	321.07
P值	?	<0.01

表3 各组别γδΤ细胞内IL-2表达的比较(%，±s)

组别	样本数	IL-2表达
γδΤ细胞组	5	0.55±0.07
γδΤ细胞＋PMA＋IM组	5	0.91±0.12^a
γδΤ细胞＋PMA＋IM＋BFA组	5	50.65±6.25^bc
PBMC＋PMA＋IM＋BFA组	5	0.21±0.03^def
F值	?	321.07
P值	?	<0.01

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